ICS07.080 A40/49 中华人民共和国国家标准 GB/T32132—2015 动物性材料(羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒)属 性DNA鉴定方法 实时荧光PCR法 DNAidentificationofwool,cashmere,duck’sdown,goose’sdownanimal materials—Real-timefluorescencePCRmethod 2015-10-09发布 2016-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、珠海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:陈国培、赖心田、林霖、周李华、梁玉英、莫秋华、洪晓明、唐复润、胡科新、 何永盛、杨友红、杨志敏、杨国武、杨泽。 ⅠGB/T32132—2015 动物性材料(羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒)属 性DNA鉴定方法 实时荧光PCR法 1 范围 本标准规定了羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒动物性材料中DNA成分实时荧光PCR定性检验方法。 本标准适用于动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 本标准使用十二烷基磺酸钠-异硫氰酸胍-β-巯基乙醇法或其他等效DNA提取法,获得适用于实时 荧光PCR检测的DNA。同时依据多种动物的物种特异性基因片段设计成特异性荧光引物,通过实时 荧光PCR反应,检测其中是否含有各种动物源性DNA成分,从而达到对动物性材料进行属性DNA成 分定性检测的目的。 4 仪器设备及器具 4.1 实时荧光PCR仪。 4.2 超净工作台。 4.3 离心机(最高转数15000g)。 4.4 微量移液器:0.2μL~2μL,1μL~10μL,2μL~20μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。 4.5 恒温水浴锅:(65±1)℃。 4.6 超纯水系统(电阻率>18.2MΩ·cm)。 4.7 紫外分光光度计:230nm、260nm、280nm。 5 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂,水应符合GB/T6682一级水要求。 5.1 2%SDS溶液:称取2gSDS(sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt,十二烷基磺酸钠)粉末,加入 5mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)[Tris-:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷] 及4mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸),加水定容至 100mL,室温保存。 5.2 异硫氰酸胍提取液:称取47.25g异硫氰酸胍、1.75g氯化钠、4gPVPK-40(Polyvinylpyrrolidone K-40,聚乙烯吡咯烷酮K-40),加入5mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)及4mL0.5mol/LEDTA 1GB/T32132—2015 (pH8.0),加水定容至100mL,室温保存。 5.3 1mol/LTris-HCl(pH8.0):800mL水中溶解121.1gTris碱,盐酸调pH值至8.0,加水至 1000mL,高压灭菌,室温保存。 5.4 0.5mol/LEDTA(pH8.0):800mL水中溶解186.1g乙二胺四乙酸二钠盐,NaOH调pH值至 8.0,补水至1000mL,高压灭菌,室温保存。 5.5 3mol/L乙酸钠溶液:称取408.1g三水乙酸钠,加入800mL水溶解,用冰乙酸调节pH值至5.2, 加水定容至1000mL,高压灭菌,4℃保存。 5.6 酚∶氯仿∶异戊醇:25∶24∶1(体积比)。 5.7 担体:非同一物种的植物或非脊椎动物基因组DNA,推荐使用糖原。 5.8 无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇等有机试剂。 5.9 PremixExTaq(2×),也可用等效的其他Taq酶或Taq酶预混液。 5.10 引物和探针:动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分实时荧光PCR检测所用 的荧光引物序列见表1。 表1 实时荧光PCR检测所用荧光引物序列 检测基因 引物序列 探针序列 脊椎动物 内参照基因5’-AGATAGAAACCGACCTGGATT-3’ 5’-TTTACGACCTCGATGTTGGAT-3’5’-FAM-TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA-BHQ-3’ 羊毛内源基因 羊绒内源基因5’-ACTTCCAATCAGTGAAATTGAC-3’ 5’-TTCTCCGAGGTCACCCCAA-3’5’-FAM-TGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGA-BHQ-3’ 5’-FAM-TGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAG-BHQ-3’ 鸭绒内源基因 鹅绒内源基因5’-ACGTACATACCGCCCGTCA-3’ 5’-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT-3’5’-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA-BHQ-3’ 5’-FAM-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHQ-3’ 5’-FAM-ATAACTAATACCATAAATACGCTGAA-BHQ-3’ 6 操作步骤 6.1 模板DNA的提取 6.1.1 十二烷基磺酸钠-异硫氰酸胍-β-巯基乙醇DNA提取法 于样品不同部位取样,取0.05g~0.1g剪碎样品,加入3mL2%SDS溶液,65℃水浴1.5h,不时 振荡;12000g离心5min,弃去上清液;加入3mL异硫氰酸胍提取液及60μLβ-巯基乙醇,65℃水浴 4.5h,不时振荡;12000g离心5min,吸取上清液;加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),颠倒混 匀;12000g离心10min;吸取上清液,加入3μL20mg/mL糖原,1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液 (pH5.2)及等体积异丙醇,-20℃沉淀过夜,12000g离心15min收集沉淀;小心倒去上清,用70%乙 醇洗涤二次,风干;加入50μL灭菌去离子水溶解沉淀。 6.1.2 模板DNA提取的其他办法 可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 6.1.3 样品DNA质量评估 取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL,用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm的吸光 2GB/T32132—2015 值,DNA的浓度按照式(1)计算,当OD260/OD280比值在1.5~2.0之间时,符合PCR检测要求。扩增前 将所有样品DNA调至约10ng/μL~100ng/μL。 c=A×N×500/1000 …………………………(1) 式中: c———DNA浓度,单位为纳克每微升(ng/μL); A———260nm处的吸光值; N———核酸稀释倍数。 6.2 试样的PCR反应 6.2.1 阳性对照和空白对照的设置 6.2.1.1 阳性对照 以含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板。 6.2.1.2 阴性对照 以不含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板。 6.2.1.3 空白对照 设置两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品),二是PCR反应的空白对照(以 水代替DNA模板)。 6.2.2 实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2,每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全落入 反应液中,不要粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。 表2 实时荧光PCR反应体系 试剂名称 体积 PremixExTaq(2×) 10μL 10μmol/L引物(上游) 0.4μL 10μmol/L引物(下游) 0.4μL 10μmol/L探针 0.2μL DNA模板 10ng~100ng 补水至 20μL 注:表中DNA模板的加样量,可视所提取DNA的浓度适当增减模板量。 6.2.3 实时荧光PCR反应参数 实时荧光PCR反应参数为:预变性95℃30s,95℃5s,60℃34s,40个循环。 注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。GB/T32132—2015 GB/T32132—2015 6.3 结果分析 6.3.1 基线的设置 实时荧光PCR反应结束后,应设置无效基线范围。基线范围选择在3个~15个循环,如果有强阳 性样本,应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常空白对照扩增曲线的最高 点,且Ct值=35为准。 6.3.2 实时荧光PCR定性检验的质量控制 提取空白对照及PCR空白对照Ct值大于或等于35,阳性对照Ct值小于35。 上述指标有一项不符合者,应重做实时荧光PCR扩增。 7 结果判断与表达 7.1 结果判断 待测DNA成分内源基因Ct值大于或等于35,脊椎动物内参照基因Ct值小于35,阳性对照、阴性 对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品未检出×××源性DNA成分。 待测DNA成分内源基因Ct值小于35,脊椎动物内参照基因Ct值小于35,阳性对照、阴性对照和 空白对照结果正常者,则可判定该样品检出×××源性DNA成分。 待测DNA成分内源基因Ct值大于或等于35,脊椎动物