ICS07.080 G60/69 中华人民共和国国家标准 GB/T32131—2015 辣根过氧化物酶活性检测方法 比色法 Determinationoftheactivityofhorseradishperoxidase—Colorimetricmethod 2015-10-09发布 2016-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省出入境检验检疫局、珠 海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:赖心田、张世伟、唐栋、周李华、胡科新、洪晓明、严琼英、刘斌、樊学军、杨泽、 杨国武。 ⅠGB/T32131—2015 辣根过氧化物酶活性检测方法 比色法 1 范围 本标准规定了辣根过氧化物酶活性检测方法。 本标准适用于生化试剂、工业产品中辣根过氧化物酶活性的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酶活性单位 activityunit 在25℃,pH7.0时,每分钟催化转化一个微摩尔过氧化氢的酶量。 4 原理 辣根过氧化物酶能迅速催化过氧化氢氧化愈创木酚(又名邻甲氧基苯酚,化学式:C7H8O2)生成棕 色的四邻甲氧基连酚,通过436nm处吸光度值的变化计算其酶活力。 反应式为: 5 仪器设备及器具 5.1 pH计。 5.2 分析天平:感量0.0001g。 5.3 紫外-可见分光光度计。 1GB/T32131—2015 5.4 1cm比色皿。 6 试剂 6.1 0.1mol/L磷酸二氢钠 称取NaH2PO4·2H2O15.6g(或NaH2PO4·H2O13.8g)加蒸馏水至1000mL溶解。 6.2 0.1mol/L磷酸氢二钠 称取Na2HPO4·12H2O35.816g(或Na2HPO4·7H2O26.8g或Na2HPO4·2H2O17.8g)加蒸 馏水至1000mL溶解。 6.3 A液:0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液。由38mL按6.1条配制的0.1mol/L磷酸二氢钠,62mL 按6.2配制的0.1mol/L磷酸氢二钠,加蒸馏水定容至100mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)。 6.4 B液:20mmol/L愈创木酚水溶液。由0.22mL愈创木酚用蒸馏水定容至100mL。 6.5 C液:8mmol/L过氧化氢水溶液。由0.082mL30%过氧化氢用蒸馏水定容至100mL。 6.6 蒸馏水:二重石英蒸馏水。 7 分析步骤 7.1 固体样品待测酶液的制备 称取酶粉0.1g,精确至0.0001g,加入10mLA液溶解,再用A液稀释至适宜浓度(见7.3)。 7.2 液体样品待测酶液的制备 吸取液体酶1mL,用A液稀释至适宜浓度(见7.3)。 7.3 测定 所用试剂及样品溶液测定前于25℃±2℃恒温箱中孵育30min。 于1cm比色皿中,按次序加入2.8mLA液,0.1mLB液,0.05mLC液和0.05mL蒸馏水作为参 比溶液。于另只1cm比色皿中,按次序加入2.8mLA液,0.1mLB液,0.05mLC液和0.05mL酶 液。快速混匀后,于分光光度计436nm波长下,测定初始时和2min后的吸光度值,两者之差即为ΔA (ΔA的值在0.080~0.400之间方为有效,如大于0.4应调整稀释度)。每次测定至少完成2个平行 实验。 8 结果计算 8.1 液体样品酶活力U按式(1)计算: U=ΔA×3.0×4×D 25.5×1×0.05×2×1000 …………………………(1) 式中: U ———液体样品酶活力,单位为毫升(mL); ΔA———样品吸光度变化值; 3.0———反应试剂的总体积,单位为毫升(mL); 4———四邻甲氧基连酚换算成过氧化氢的量的系数; D———稀释倍数; 25.5———四邻甲氧基连酚的摩尔消光系数,单位为升每摩尔厘米[L/(mol·cm)]; 2GB/T32131—2015 1———比色皿光径,单位为厘米(cm); 0.05———参与反应酶液的体积,单位为毫升(mL); 2———反应时间,单位为分(min)。 计算结果保留三位有效数字。 8.2 固体样品酶活力U按式(2)计算: U=ΔA×3.0×4×D 25.5×1×0.05×2×V m×1000…………………………(2) 式中: U ———固体样品酶活力,单位为克(g); ΔA———样品吸光度变化值; 3.0———反应试剂的总体积,单位为毫升(mL); 4———四邻甲氧基连酚换算成过氧化氢的量的系数; D———稀释倍数; 25.5———四邻甲氧基连酚的摩尔消光系数,单位为升每摩尔厘米[L/(mol·cm)]; 1———比色皿光径,单位为厘米(cm); 0.05———参与反应酶液的体积,单位为毫升(mL); 2———反应时间,单位为分(min); m———称取酶粉的质量,单位为克(g); V———溶解酶粉的液体体积,单位为毫升(mL)。 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。GB/T32131—2015