ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28984—2012 香 蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofbananabractmosaicvirus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:闻伟刚、郭立新、杨翠云、陈先锋、雷荣、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽。 ⅠGB/T28984—2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了香蕉苞片花叶病毒血清学和分子生物学特征的检测方法。 本标准适用于香蕉组培苗和植株等芭蕉属寄主植物材料中香蕉苞片花叶病毒的检测,也适用于蚜 虫等传播媒介中该病毒的检测。 2 香蕉苞片花叶病毒基本信息 中文名:香蕉苞片花叶病毒 学名:bananabractmosaicvirus 缩写:BBrMV 属马铃薯Y病毒属(Potyvirus),香蕉苞片花叶病毒其他信息参见附录A。 3 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(Doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay,DAS-ELISA)、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescentRT-PCR)进行检测鉴定。 4 仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备 常规PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(感量:0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像 系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-80℃)、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪。 4.2 用具 可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 4.3 试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。 5 检测 5.1 样品制备 取0.5g~10g畸形、变色等症状的叶片或其他植物组织,在研钵或小型食品加工机中充分研磨, 1GB/T28984—2012 取五分之一量的均匀后样品,转入离心管中,按1∶10(质量∶体积)加入样品提取缓冲液振荡混匀。媒 介昆虫按1∶10(质量∶体积)加入样品提取缓冲液研磨混匀。2000g离心10min,上清液即为 DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液。 注:提取液在3h内使用,否则保存在4℃条件下。 5.2 检测方法 5.2.1 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA) DAS-ELISA检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染BBrMV的植物组织作阳性 对照,用样品提取缓冲液作空白对照。其中,阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致。 具体操作步骤见附录B。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 5.2.2 RT-PCR方法 RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染BBrMV的植物组织作阳性对 照,用ddH2O作空白对照。 具体操作步骤见附录C。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 5.2.3 实时荧光RT-PCR方法 实时RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染BBrMV的植物组织作阳性 对照,用ddH2O作空白对照。 具体操作步骤见附录D。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 6 结果判定 样品经DAS-ELISA与RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带香蕉苞片花叶病毒。 样品经DAS-ELISA与实时荧光RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带香蕉苞片花叶 病毒。 7 样品保存与记录 7.1 样品保存 经检测确定携带香蕉苞片花叶病毒的样品保存在-80℃冰箱中,并做好登记和标记工作。样品保 存期限至少1年。 7.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等。血清学测定 需有酶联反应吸光值的原始数据,RT-PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR需要有荧光曲线图 与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。 2GB/T28984—2012 附 录 A (资料性附录) 香蕉苞片花叶病毒相关资料 A.1 名称 中文名:香蕉苞片花叶病毒 学 名:bananabractmosaicvirus 缩 写:BBrMV 分类地位:马铃薯Y病毒属(Potyvirus) A.2 寄主范围 目前只发现芭蕉属(Musaspp.)植物为其自然寄主。 A.3 为害症状 病毒侵染香蕉植株后,病叶上沿着叶柄产生深绿色或褐色的梭条斑。而病株花序苞片上则出现黑 色斑点,这些症状常常十分明显,引起香蕉减产和品质下降。 A.4 分布地区 该病毒主要分布于菲律宾和印度等国,在我国尚未见发生。 A.5 传播方式 可由玉米缢管蚜(Rhopalosiphurnmaidis)和棉蚜(Aphisgossypii)以非持久方式传播,长距离扩 散则随感病植株的无性繁殖材料传播。 A.6 粒体形态 病毒粒子线形,长660nm~760nm,直径12nm。 A.7 基因组 能被SDS降解,用硫酸铯溶液提取时,多数粒子的相对分子质量为38KDa,少数为55KDa;用蔗 糖溶液提取时,除上述分子外,还有少数相对分子质量为66KDa和21KDa的分子存在。 3GB/T28984—2012 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA) B.1 试剂 B.1.1 10×PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 80g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 11.5g 氯化钾(KCl) 2g 吐温(Tween-20) 5mL 溶于900mL的灭菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4,并定容至1000mL。 B.1.2 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 20g 叠氮钠(NaN3) 0.2g Tween-20 20mL 溶于900mL的1×PBST中,用HCl调节pH至7.4,并定容至1000mL。 B.1.3 包被抗体缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 溶解于900mL灭菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至9.6,并定容至1000mL。 B.1.4 酶标抗体缓冲液(pH7.4) 1×PBST缓冲液 800mL 牛血清白蛋白(BSA) 2g PVP(MW24000~40000) 20g 用灭菌蒸馏水定容至1000mL。 B.1.5 底物(ρNPP)缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺 97mL NaN3 0.2g 溶解于600mL的灭菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至9.8,然后定容至1000mL。 B.2 检测 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将BBrMV抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,室温孵育2h或4℃包 被过夜。 4GB/T28984—2012 B.2.2 加样 清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗6~8次,在吸水纸上拍干。每孔加入100μL制备好的 样品检测粗提液,每个样品设2个重复。同时,设置阴性对照、阳性对照和空白对照。室温孵育2h或 4℃过夜。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体缓冲液将酶标抗体按说明稀释。清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗6~8次, 在吸水纸上拍干。每孔加入100μL酶标抗体溶液,室温孵育2h。 B.2.4 加底物 将底物ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)。清空酶联板孔中溶液,用 PBST缓冲液清洗6~8次,在吸水纸上拍干。每孔加入100μL底物溶液,室温避光孵育至阳性对照孔 显色明显(约30min~60min)。 B.2.5 吸光值的测定 用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值并记录。 B.3 结果判定 B.3.1 质量控制要求 缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15,阴性对照孔的OD405值小于0.05时,按0.05计算。阳性 对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照式(B.1)进行计算: P=OD1-OD2 (OD1+OD2)×1/2×100%…………………………(B.1) 式中: P ———平行允许率; OD1———重复样品1; OD2———重复样品2。 当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效。 B.3.2 若满足不了B.3.1的质量要求,则不能进行结果判定。 B.3.3 在满足了B.3.1的质量要求后,则按如下原则作出判定: 样品OD405/阴性对照OD405值≥2,结果判定为阳性; 样品OD405/阴性对照OD405值<2,判为阴性。 5GB/T28984—2012 附 录 C (规范性附录) RT-PCR方法 C.1 主要试剂 C.1.1 RNA提取试剂 Trizol、三氯甲烷、