ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28982—2012 番 茄斑萎病毒PCR检测方法 DetectionoftomatospottedwiltvirusbyPCR 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫 局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:于翠、杨翠云、廖富荣、易建平、邓丛良、戚龙君。 ⅠGB/T28982—2012 番茄斑萎病毒PCR检测方法 1 范围 本标准规定了番茄斑萎病毒的RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于包括种子、苗木和无性繁殖材料的活体植物材料及传毒介体中携带的番茄斑萎病毒 的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 番茄斑萎病毒基本信息 中文名:番茄斑萎病毒 英文名:tomatospottedwiltvirus 缩写:TSWV 分类地位:布尼亚病毒科(Bunyaviridae),番茄斑萎病毒属(Tospovirus) 番茄斑萎病毒其他信息参见附录A。 4 方法原理 用特异性抗体修饰的磁株吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA,或直接从待 测样品材料中提取植物总RNA,然后在逆转录酶的作用下合成cDNA,以cDNA为模板再通过普通 RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行检测。分析PCR结果即可明确材料中是否含有病毒核酸成分。 5 仪器、用具及试剂 5.1 仪器设备 PCR仪,实时荧光PCR仪,旋转孵育器,电泳仪,凝胶分析成像系统,水浴锅,高速冷冻离心机,高 压灭菌锅,微波炉,涡旋振荡器,电子天平(感量0.001g),超低温冰箱(-80℃)等。 5.2 用具 磁力架,可调式微量移液器,无RNase吸头,无RNase离心管,PCR管,研钵等。 5.3 试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。试剂配制见附录B。 番茄斑萎病毒抗体,磁珠(具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子,直径280nm,表面标记有甲苯磺酰基), 1GB/T28982—2012 Trizol或RNA抽提试剂盒,三氯甲烷,异丙醇,无水乙醇,无RNAase水,逆转录试剂盒,PCR反应相关 试剂,溴化乙锭,DNA相对分子质量标记(100bp~2000bp),琼脂糖等。 6 抽样和样品制备 6.1 症状观察 现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,TSWV为害症状描述参见附录A。 6.2 抽样 尽量抽取有病毒为害症状的植物材料送检,当寄主植物无症状时,也需要抽样送检。若在抽样过程 中发现蓟马,则需高度重视,植物样品和发现的所有蓟马装入虫样管中送实验室检测。抽样方法按 SN/T2122中规定执行。 6.3 样品制备 如果是种苗样品,建议在植物的不同部位采样、制样以避免病毒在植物体内分布的不均匀;将待测 样品放入研钵后加入液氮研磨,取100mg用于抽提RNA;或者将待测样品在常温下研磨后加入样品 抽提缓冲液,离心取上清液用于免疫磁珠分离。 7 检测鉴定 采用RT-PCR(见附录C)、免疫磁珠RT-PCR(见附录D)和实时荧光RT-PCR(见附录E)进行病毒 检测、鉴定。 8 结果判定 8.1 样品经RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时,判定样品 不携带番茄斑萎病毒。 8.2 样品经RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR检测为阳性,需要进行序列测定,如果序列测定结果证实与 所检测的番茄斑萎病毒一致,则可判定携带番茄斑萎病毒。 8.3 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时,也可判定样品携带番茄斑萎病毒。 9 样品保存和结果记录 9.1 样品保存 经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子在干燥条件下保存 6个月,其他繁殖材料在-20℃保存,带毒介体则保存于-80℃。做好登记和标记工作。 9.2 结果记录 记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。 RT-PCR检测或免疫磁珠RT-PCR应有电泳结果照片及序列测定报告,实时荧光RT-PCR应有扩增曲 线图片等。 2GB/T28982—2012 附 录 A (资料性附录) 番茄斑萎病毒相关资料 A.1 生物学特性 A.1.1 主要寄主 番茄斑萎病毒的寄主范围很广,可侵染70个科925种植物。主要寄主包括:番茄(Lycopersicon esculentum)、辣椒(Capsicumannuum)、莴苣(Lactucasativa)、豌豆(Pisumsativum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、凤梨(Ananascomosus)、落花生(Arachishypogaea)、刀豆 (Canavaliagladiata)、菽麻(Crotalariajuncea)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthusannuus)、 假酸浆(Nicandraphysaloides)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、灯笼果(Physalisperuviana)、茄子 (Solanummelongena)、灰毛豆(Tephrosiapurpurea)、蚕豆(Viciafaba)、黑吉豆(Vignamungo)、绿豆 (Vignaradiata)、豇豆(Vignaunguiculata)、百日菊(Zinniaelegans)、六出花(Alstroemeria aurantiaca)、银莲花(Anemonecathayensis)、旱芹(Apiumgraveolens)、秋海棠(Begoniaevansiana)、 冬瓜(Benincasahispida)、番木瓜(Caricapapaya)、菊苣(Cichoriumintybus)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、西瓜(Citrulluslanatus)、翠菊(Callistephuschinensis)、长春花(Catharanthusroseus)、 黄瓜(Cucumissativus)、西葫芦(Cucurbitapepo)、树番茄(Cyphomandrabetacea)、菜蓟(Cynara scolymus)、大丽花(Dahliapinnata)、紫色洋桔梗(Eustomarussellianum)、橡胶树(Ficuselastica)、 薜荔(Ficuspumila)、非洲菊(Gerberajamesonii)、辣子草(Galinsogaparviflora)、棉属(Gossypium Linn.)、凤仙花属(ImpatiensLinn.)、家山黧豆(Lathyrussativus)、羽扇豆(Lupinuspolyphyllus)、 辣薄荷(Menthapiperita)、文心兰属(Oncidium)、蝴蝶兰属(PhalaenopsisBlume)、佛手瓜(Sechium edule)、大岩桐(Sinningiaspeciosa)、葡萄(Vitisvinifera)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、 碧冬茄属(PetuniaJuss.)、菊花(Dendranthemamorifolium)、天竺葵(Pelargoniumhortorum)、罗勒 (Ocimumbasilicum)等。 A.1.2 野生寄主 杂草也是番茄斑萎病毒及其传毒介体重要的中间宿主,主要包括:刺苋(Amaranthusspinosus)、 繁缕(Stellariamedia)、藜(Chenopodiumalbum)、牛蒡(Arctiumlappa)、三爷鬼针草(Bidenspilosa)、 辣子草(Galinosogaparviflora)、苦苣菜(Sonchusoleraceus)、芥菜(Capsellabursa-pastoris)、草木犀 (Meliltusofficinalis)、小花堇葵(Malvaparviflora)、匙叶草(Limoniumlatifolium)、马齿苋 (Portulacaoleraceae)、龙葵(Solanumnigrum)、旱金莲(Tropaeolummajus)、马鞭草(Verbena litoralis)等。 A.1.3 受影响的植物部分 整株、叶片、果实/荚。 A.1.4 危害症状 TSWV的危害症状,即使是在同一寄主植物上,也会因品种、年龄、营养状况和环境条件的不同有 很大差异,该病毒在一些重要经济作物和观赏植物上产生的症状如下: ———番茄上的症状:叶子呈青铜色、卷曲、出现坏死条纹和斑点,叶柄、茎和茎尖也产生黑褐色条纹。 与健康植株相比,被害植物矮小。红色或黄色的番茄成熟时表皮出现暗红色和黄色块斑。坏 3GB/T28982—2012 死严重时,能够导致植株死亡。偶尔症候仅在水果上发现。 ———辣椒上的症状:植株矮化和黄化,叶片出现褪绿线纹或花叶并伴有坏死斑,茎上坏死条纹从茎 部蔓延至枝端。成熟果实产生黄化,伴有同心环或坏死条纹。 ———莴苣上的症