ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28981—2012 齿 兰环斑病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofodontoglossumringspotvirus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:闻伟刚、陈先锋、杨翠云、郭立新、鲁洁、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽。 ⅠGB/T28981—2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了齿兰环斑病毒血清学和分子生物学特征的检测方法。 本标准适用于种子、种球、花卉和种苗等植物材料中齿兰环斑病毒的检测,也适用于蚜虫等传播媒 介中该病毒的检测。 2 齿兰环斑病毒基本信息 中文名:齿兰环斑病毒 学 名:odontoglossumringspotvirus 缩 写:ORSV 属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),齿兰环斑病毒其他信息参见附录A。 3 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(Doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay,DAS-ELISA)、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescentRT-PCR)进行检测鉴定。 4 仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备 PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(感量:0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、 高速冷冻离心机、超低温冰箱(-80℃)、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪。 4.2 用具 可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 4.3 试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。 5 检测 5.1 样品制备 取0.5g~10g种子、种球鳞片或畸形、变色症状的叶片等植物组织,在研钵或小型食品加工机中 1GB/T28981—2012 充分研磨,取五分之一量的均匀后样品,转入离心管中,按1∶10(质量∶体积)加入样品提取缓冲液振 荡混匀。媒介昆虫按1∶10(质量∶体积)加入样品提取缓冲液研磨混匀。2000g离心10min,上清液 即为DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液。 注:提取液在3h内使用,否则保存在4℃条件下。 5.2 检测方法 5.2.1 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA) DAS-ELISA检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染ORSV的植物组织作阳性对 照,用样品提取缓冲液作空白对照。其中,阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致。 具体操作步骤见附录B。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 5.2.2 RT-PCR方法 RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染ORSV的植物组织作阳性对照, 用ddH2O作空白对照。 具体操作步骤见附录C。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 5.2.3 实时荧光RT-PCR方法 实时RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染ORSV的植物组织作阳性 对照,用ddH2O作空白对照。 具体操作步骤见附录D。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 6 结果判定 样品经DAS-ELISA与RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带齿兰环斑病毒。 样品经DAS-ELISA与实时荧光RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带齿兰环斑病毒。 7 样品保存与记录 7.1 样品保存 经检测确定携带齿兰环斑病毒的样品保存在-80℃冰箱中,并做好登记和标记工作。样品保存期 限至少1年。 7.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等。血清学测定 需有酶联反应吸光值的原始数据,RT-PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR需要有荧光曲线图 与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。 2GB/T28981—2012 附 录 A (资料性附录) 齿兰环斑病毒相关资料 A.1 名称 中文名:齿兰环斑病毒 学 名:odontoglossumringspotvirus 缩 写:ORSV 分类地位:烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。 A.2 寄主范围 主要寄主是建兰(Cymbidiumensifolium)、蝴蝶兰(Phalaennopsissp.)、文心兰(Oncidiumsp.)等 兰科(Orchidaceae)植物。 A.3 为害症状 感染了ORSV的兰花,叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块,花部甚至出现畸形或褪色斑,红 色系花朵尤为明显。 A.4 分布地区 在世界各地均有分布。 A.5 传播方式 可通过无性繁殖材料、机械操作携带汁液、蚜虫等传播。 A.6 粒体形态 长约300nm,宽约18nm的杆状病毒,颗粒中轴可清楚分辨,部分病毒头尾相连。 A.7 基因组 ORSV粒体分散在细胞质内基晶格排列。内含体为X—体,病毒基因组6395nt。沉降系数 211.6S,核酸为单链RNA,相对分子质量2×106。 3GB/T28981—2012 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA) B.1 试剂 B.1.1 10×PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 80g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 11.5g 氯化钾(KCl) 2g 吐温(Tween-20) 5mL 溶于900mL的灭菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4,并定容至1000mL。 B.1.2 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 20g 叠氮钠(NaN3) 0.2g Tween-20 20mL 溶于900mL的1×PBST中,用HCl调节pH至7.4,定容至1000mL。 B.1.3 包被抗体缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 溶解于900mL灭菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至9.6,并定容至1000mL。 B.1.4 酶标抗体缓冲液(pH7.4) 1×PBST缓冲液 800mL 牛血清白蛋白(BSA) 2g PVP(MW24000~40000) 20g 用灭菌蒸馏水定容至1000mL。 B.1.5 底物(ρNPP)缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺 97mL NaN3 0.2g 溶解于600mL的灭菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至9.8,然后用灭菌蒸馏水定容 至1000mL。 B.2 检测 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将ORSV抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,室温孵育2h或4℃包被 过夜。 4GB/T28981—2012 B.2.2 加样 清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗6~8次,在吸水纸上拍干。每孔加入100μL制备好的 样品检测粗提液,每个样品设2个重复。同时,设置阴性对照、阳性对照和空白对照。室温孵育2h或 4℃过夜。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体缓冲液将酶标抗体按说明稀释。清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗6~8次, 在吸水纸上拍干。每孔加入100μL酶标抗体溶液,室温孵育2h。 B.2.4 加底物 将底物ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)。清空酶联板孔中溶液,用 PBST缓冲液清洗6~8次,在吸水纸上拍干。每孔加入100μL底物溶液,室温避光孵育至阳性对照孔 显色明显(约30min~60min)。 B.2.5 吸光值的测定 用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值并记录。 B.3 结果判定 B.3.1 质量控制要求 缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15,阴性对照孔的OD405值小于0.05时,按0.05计算。 阳性对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照式(B.1)进行计算: P=OD1-OD2 (OD1+OD2)×1/2×100%…………………………(B.1) 式中: P———平行允许率; OD1———重复样品1; OD2———重复样品2。 当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效。 B.3.2 若满足不了B.3.1的质量要求,则不能进行结果判定。 B.3.3 在满足了B.3.1的质量要求后,则按如下原则作出判定: 样品OD405/阴性对照OD405值≥2,结果判定为阳性; 样品OD405/阴性对照OD405值<2,判为阴性。 5GB/T28981—2012 附 录 C (规范性附录) RT-PCR方法 C.1 主要试剂 C.1.1 RNA提取试剂 Trizol、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH2O。 C.1.2