ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28979—2012 欧 芹壳针孢检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofSeptoriapetroselini 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人:林石明、廖富荣、陈青、黄蓬英、陈红运、王宏毅、吴媛。 ⅠGB/T28979—2012 欧芹壳针孢检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了欧芹壳针孢的检测和鉴定方法。 本标准适用于欧芹属种子、苗木及其产品中欧芹壳针孢的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18085—2000 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 SN/T1809 进出境植物种子检疫规程 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 欧芹壳针孢基本信息 拉丁学名:Septoriapetroselini(Libert)Desmazières 中文名称:欧芹壳针孢 属真菌界(Fungi),无性真菌门(Anamorphicfungi),未分目(曾归为球壳孢目Sphaeropsidales),未 分科(曾归为球壳孢科Sphaeropsidaceae),壳针孢属(Septoria)。至今尚未发现其有性阶段。 欧芹壳针孢自然侵染欧芹(Petroselinumcrispum)和芫荽(Coriandrumsativum),引起欧芹壳针孢 叶斑病。该病菌主要通过感染的种子进行远距离传播,种子是重要的初侵染源。 欧芹壳针孢的其他相关信息参见附录A。 4 方法原理 本标准通过分离培养,根据菌落形态特征,病原菌无性世代的分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子 的形态特征,结合病菌所引起的主要危害症状,对该病原进行鉴定。 5 主要试剂、仪器设备和用具 5.1 主要试剂 次氯酸钠,蔗糖,甘油,琼脂,酒精等。 5.2 仪器设备 超净工作台,高压灭菌锅,光照培养箱,生物显微镜(20×~400×)等。 5.3 用具 白瓷盘,培养皿,酒精灯,吸水纸,载玻片,盖玻片,刀片,手术剪,镊子,尖头镊子,刷子,pH计,血球 1GB/T28979—2012 计数板,塑料袋,离心管等。 6 抽样与检查 按SN/T1809或SN/T2122规定的抽样方法进行抽样检查。 检查种子、苗木及其产品是否有病斑、小黑点(分生孢子器)等(参见附录A)。若有小黑点,直接切 片在显微镜下检查。受感染的叶片初为黄色小斑,随后变成浅黄色至黄褐色,最后为褐色的病斑。病斑 边缘颜色稍深,为坏死圈。病斑圆形至长圆球形,或不规则,平均3mm~8mm,最大的直径约13mm, 边缘具窄的褐色的坏死线。在叶柄上为卵圆形、暗褐色的小病斑。叶面上病斑产生黑色小点(即分生孢 子器)。在种子表面具黑色小病斑或小黑点。 7 病菌分离 7.1 植物组织中病菌的分离 将植物组织用1%的次氯酸钠消毒2min~5min,用无菌蒸馏水冲洗,在无菌条件下晾干,放置在 PDA培养基上,于20℃~25℃下培养3d~5d后,挑取菌落边缘菌丝进行纯化。 7.2 种子中病菌的分离 7.2.1 洗涤检查 称取50g或适量的种子,加无菌水100mL,在振荡器中振荡5min,取洗涤液在1000r/min离心 3min,弃上清液,在沉淀中加入适量(约1mL)的席尔氏液(配制方法见GB/T18085—2000的附录A) 悬浮,取1滴(约50μL)的悬浮液在显微镜下(20×~400×)检查。 7.2.2 分离培养 检查异常的种子,挑取表面具有小黑点的种子,或随机挑取种子,每份样品至少检测400粒种子。 用蒸馏水将吸水纸充分湿润(避免产生多余的水),种子均匀置于吸水纸或PDA培养基上(如直径9cm 的培养皿约25粒/皿),加盖后,在20°C~22°C,在12h紫外光和12h黑暗下交替培养。或者先在 20°C下培养24h,而后于-20°C冷冻24h。5d~7d后观察培养结果,挑取可疑菌落进行分离纯化。 8 病菌鉴定 8.1 形态特征 8.1.1 在PDA培养基上(见附录B),菌落糠秕状,呈暗褐色(参见图A.3)。从病组织或分离纯化所得 的菌落挑取的分生孢子器,在立体显微镜下进行形态观察和切片(最好能够从孔口处切开),根据分生孢 子器、分生孢子梗和分生孢子的形态特征进行鉴定。 8.1.2 分生孢子器埋生于表皮下或稍微突出,单室,球形至近球形,有些较扁,黄色至黑褐色,直径 55μm~200μm;具近圆形至椭圆形孔口,直径20μm~40μm。分生孢子器壁由多角形的厚壁细胞所 组成,厚壁细胞直径为3μm~5μm,黄色至褐色。分生孢子梗短,瓶梗形,无色透明,从分生孢子器的 内壁伸出,产孢方式为全壁芽生合轴式。分生孢子具0~4个真隔膜,一般为1~3个隔膜,未成熟的可 能没有隔膜,无色透明,线状或近圆柱形,(1.0μm~1.5μm)×(22μm~51μm),长宽比例大于10,通 常稍微弯曲,基部钝圆而顶部渐尖。参见图A.4~图A.6。 2GB/T28979—2012 8.2 致病性测定 8.2.1 接种体制备 刮取在PDA培养3d的可疑菌落的分生孢子,用无菌水配制成105CFU/mL~106CFU/mL孢子 悬浮液。 8.2.2 接种试验 将欧芹种子播种于小盆钵中,每盆播种5~8粒种子,生长5周~7周,备用。用刷子轻扫欧芹幼苗 叶片进行创伤,将孢子悬浮液喷雾接种于欧芹的叶片上,每盆接种5株,重复二次。用无菌水作空白对 照。如可能,采用欧芹壳针孢已知菌株作阳性对照。接种后用干净的塑料袋包扎封口,在饱和湿度,于 20°C下黑暗中培养48h后,去掉塑料袋,在65%~70%的相对湿度下,移入培养箱,20°C~25°C下黑 暗中培养;注意观察,一般在14d后就产生典型的症状。 9 结果判定与样品保存 9.1 结果判定 9.1.1 未分离到可疑菌落 病菌分离培养7d后,仍未产生可疑菌落,则未检出。 9.1.2 分离到可疑菌落 分离培养后的可疑菌落,其形态特征如果符合8.1描述的鉴定特征,经致病性接种试验又产生典型 的症状,而空白对照没有表现症状,则判定为检出;可疑菌落没有产生典型的症状,则判定为未检出。 9.2 记录及样品保存 检测报告应包含所采用的病菌分离方法,包括菌落形态特征、致病性测定所产生的症状照片等。供 试样品和所分离到的菌种,应保存在低温冰箱中,以备复核。 3GB/T28979—2012 附 录 A (资料性附录) 欧芹壳针孢相关信息 A.1 病原菌的名称 A.1.1 中文名称 欧芹壳针孢 A.1.2 英文名称 leafblightofparsley,leafspotofparsley A.1.3 拉丁学名 Septoriapetroselini(Libert)Desmazières A.1.4 同物异名 Septoriaapii(Briosi&Cavara)Rostrup.sensuKleb SeptoriaapiiChester SeptoriaapiiRostrup. Septoriaapiif.punctiformisLaib. Septoriaapii-graveolentisDorogin SeptoriapetroseliniDesm Septoriapetroselinif.apiiRoum Septoriapetroselinivar.apiiBriosi&Cavara Septoriapetroselinif.emaculataSacc A.2 病原菌的分类地位 属真菌界(Fungi),无性真菌门(Anamorphicfungi),未分目(曾经归为球壳孢目Sphaeropsidales), 未分科(曾经归为球壳孢科Sphaeropsidaceae),壳针孢属(Septoria)。至今尚未发现其有性阶段。 A.3 寄主植物 A.3.1 自然寄主 欧芹壳针孢只发现侵染欧芹(Petroselinumcrispum)和芫荽(CoriandrumsativumL.),但不侵染 芹菜(Apiumgraveolens)。与之类似的芹菜生壳针孢(Septoriaapiicola),不会侵染欧芹。欧芹壳针孢 引起欧芹叶斑病(亦称叶疫病),严重影响产量,影响种子的萌发率。 A.3.2 接种寄主 至今未发现有接种寄主。 4GB/T28979—2012 A.4 传播途径 种子是初侵染来源。病菌在干燥的病残体上可存活3年以上,种子中可存活2年以上,枯死叶片上 也可存活几周。种子上可见分生孢子器。在大田,病菌通过雨水的飞溅、风和人工或机械传带而扩散。 A.5 症状特征 症状主要表现于叶片和叶柄。叶片上初为黄色小斑,随后变黄褐色至浅黄色,最后为褐色。病斑圆 形至长圆球形,或不规则,平均3mm~8mm,最大约1.5cm。病斑边缘颜色稍深,边缘具窄的褐色坏 死线。在叶柄上为卵圆形、暗褐色的小病斑。病斑上产生黑色小点(即分生孢子器)。参见图A.1和图 A.2。 图A.1 在叶片上的症状 图A.2 在叶片病斑上的分生孢子器 潮湿的气候有利于病害发生,发病率达40%~80%。 A.6 菌形态特征 在PDA培养基上的菌落(参见图A.3),分生孢