ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28976—2012 草 莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofstrawberrylatentringspotvirus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:杨翠云、于翠、闻伟刚、郑建中、印丽萍、李彬。 ⅠGB/T28976—2012 草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于植物材料,包括无性繁殖材料、种子和苗木中草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 草莓潜隐环斑病毒基本信息 中文名:草莓潜隐环斑病毒 学 名:strawberrylatentringspotvirus 缩 写:SLRSV 分类地位:Secoviridae科,温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus) 草莓潜隐环斑病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据,采 用DAS-ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。 5 仪器设备、设施、用具和试剂 5.1 仪器设备 酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(感量0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成 像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-80℃)、高压灭菌锅、制冰机、微波 炉、涡旋振荡器。 5.2 设施 植物隔离检疫圃。 5.3 用具 可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离 心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、镊子、放大镜等。 5.4 试剂 5.4.1 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。 1GB/T28976—2012 5.4.2 SLRSV抗体、Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC)、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、β-巯基乙 醇、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA相对分子质量标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。血清学 和分子生物学检测试剂配制见附录B。 6 症状观察及抽样 6.1 症状观察 现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,SLRSV为害症状描述参见附录A。 6.2 抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按SN/T2122中规定进行抽样,并送 实验室检疫鉴定。 7 检疫鉴定 7.1 鉴定流程 判定样品中是否携带草莓潜隐环斑病毒,应经过两种或两种以上的检测方法相互验证。具体操作 流程可参照图1。 图1 SLRSV鉴定流程图 2GB/T28976—2012 7.2 双抗体酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA) 对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨,并按质量和抽提缓冲液1∶10的比例稀释,制备的汁 液分别盛装于离心管中,离心后吸取上清液作为待测样品,并设阳性对照、阴性对照和空白对照。具体 操作步骤见附录C。 7.3 RT-PCR方法 植株叶片、种球或种子液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA。具体操作步骤见附录D。 7.4 实时荧光RT-PCR方法 植株叶片、种球或种子液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA。具体操作步骤参见附录E。 7.5 鉴别寄主测定方法 在栽种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种,对DAS-ELISA或 RT-PCR检测SLRSV呈阳性的样品加入适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主。当任意一种鉴别寄主 植物出现如下描述症状时,即可判定接种成功。对接种后表现隐症的鉴别寄主植物,还需要对接种叶片 结合DAS-ELISA或RT-PCR方法验证,如果结果阳性则判定样品携带SLRSV。 a) 苋色藜(Chenopdiumamaranticolor)或昆诺藜(Chenopdiumquinoa):接种叶7d内局部褪绿 或坏死斑,以后是系统褪绿或变形,有时出现坏死或轻微的褪绿斑; b) 菜豆(Phaseolusvulgaris):接种叶出现局部褪绿或坏死斑; c) 黄瓜(Cucumissativus):系统感染黄瓜,引起脉间褪绿和坏死,有时无症状; d) 黄花烟(Nicotianarustica)或矮牵牛(Petuniahybrida):属系统性侵染且无症状出现。 7.6 免疫电镜方法 利用草莓潜隐环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒,在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态 特征,具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为30nm的球状病毒粒子,即可判定免 疫电镜结果阳性。 8 结果判定 8.1 样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性,判定该样品不携带草莓潜隐环斑病毒。 8.2 样品经DAS-ELISA检测为阳性,如果RT-PCR结果阳性,且序列测定结果证实与所检测的草莓 潜隐环斑病毒一致;或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时,可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒。 8.3 样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性,经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄 主植物出现相应的症状时,可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒。 9 样品保存与记录结果 9.1 样品保存:经检测确定携带草莓潜隐环斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保 存在干燥室温环境中;种苗、鳞球茎等样品保存在-80℃冰箱中,做好登记和标记工作。样品保存期限 至少1年。 3GB/T28976—2012 9.2 记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫员的签字等。酶联免疫 吸附测定法检测应有酶联板反应的数值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,免疫电镜检测需要有电 镜图片,RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果。实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值。 结果记录与资料保存期限至少1年。 4GB/T28976—2012 附 录 A (资料性附录) 草莓潜隐环斑病毒相关资料 A.1 寄主范围 SLRSV寄主范围比较广。自然条件下,SLRSV可以侵染许多野生和栽培的寄主植物。在机械接 种的167种双子叶植物中,受侵染的高达27科126种植物。该病毒主要为害草莓、覆盆子、欧洲甜樱 桃、百合、芦笋、黑莓、黑醋栗、红醋栗、葡萄、李子、桃子、大黄和水仙等多种植物。 A.2 为害症状 SLRSV影响寄主植物的整个生长期,绝大多数是系统性侵染但不表现症状。系统感染草莓(Fra- gariaspp.)、覆盆子(Rubusidaeus)和欧洲卫矛(Euonymuseuropaeus)形成不同程度的斑驳;为害欧洲 甜樱桃(Prunusavium)、桃(Prunuspersica)、西洋接骨木(Sambucusnigra)、黄瓜(Cucumissativus) 等,引起脉间褪绿和坏死等症状;为害芹菜(ApiumLinn.)形成舌形叶;为害刺槐(Robinia pseudoacacia)造成花叶症状;还可以侵染玫瑰(Rosarugosa)形成绿色环斑及矮化。 A.3 分布地区 欧洲:比利时、前捷克和斯洛伐克、芬兰、法国、德国、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、葡萄牙、瑞士、西 班牙、英国。 大洋洲:新西兰。 美 洲:加拿大。 A.4 传播方式 A.4.1 介体传播 SLRSV传播介体主要为裂尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudatum)和考克斯剑线虫(Xiphinema coxi),并且成虫和若虫都可以传毒。 A.4.2 种子及无性繁殖材料传毒 病毒可通过种子及种球、块茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播,如可以随百合和郁金香等种球的 调运进行传播。该病毒为害薄荷(Menthaarvensis)、宝盖草(Lamiumamplexicaule)、悬钩子(Rubus Linn.)、繁缕(Stellariamedia)、昆诺藜(Chenopodiumquinoa)和芹菜(ApiumLinn.)等寄主植物并以 种传的方式进行传播,在薄荷等寄主上的种传率超过70%。 A.4.3 摩擦接种传毒 SLRSV为害草本植物时,病毒的汁液易通过摩擦接种传毒。但当SLRSV为害木本植物时,其中 的多酚类物质抑制了病毒的侵染性,病毒汁液应置于2%的烟碱溶液中或高pH值的缓冲液中才易接 5GB/T28976—2012 种成功。 A.5 粒体形态 SLRSV颗粒大小相等,直径30nm,通常有明显的六边形轮廓。 A.6 基因组 SLRSV单链RNA,总长12.6kb,由两部分组成,分别长为7.8kb和4.8kb。在蛋白质组成上, SLRSV颗粒包含两种多肽分子,相对分子质量分别是43kDa和27kDa,而多面体属病毒一般只有一 种相对分子质量为55kDa的多肽。 6GB/T28976—2012