ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28975—2012 莴 苣花叶病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 Detectionandidentificationoflettucemosaicvirus—Nanoparticles-enlargedin colloidalgoldimmunochromatographicassay 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:李锦丰、陈艳、马吉湘、田世民、戴华、张帆、金涌、邹明强。 ⅠGB/T28975—2012 引 言 本文件的发布机构提请注意,申明符合本文件时,可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下, 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得: 该专利持有人:中国检验检疫科学研究院 联系人:邹明强 地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号 中国检验检疫科学研究院 邮编:100123 请注意除上述专利外,本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这 些专利的责任。 ⅡGB/T28975—2012 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测莴苣花叶病毒的原理、实验步骤及结果判 定等。 本标准适用于植物及其产品组织中莴苣花叶病毒的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T23629—2009 引进植物病原生物安全控制技术要求 GB/T23632—2009 进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程 3 莴苣花叶病毒基本信息 中文名:莴苣花叶病毒 学名:lettucemosaicvirus 缩写:LMV 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 莴苣花叶病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理,采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规 胶体金免疫层析试纸条进行处理,提高检测灵敏度,根据试纸条颜色的变化,判定待测样品中是否存在 莴苣花叶病毒。 5 仪器设备、用具及试剂材料 5.1 仪器设备 天平(感量,1/10000g)、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。 5.2 用具 微量移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)、研钵、离心管等。 1GB/T28975—2012 5.3 试剂材料 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定莴苣花叶病毒试剂材料(见附录B)。 6 实验步骤 6.1 生物安全与废弃物处理 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作,实验废弃物按照 GB/T23629—2009中5.7进行处理。 6.2 样品制备 称取1g植物或其产品组织,加入2mL样品提取缓冲液用研钵研磨,然后4℃下3000g~5000g 离心10min,取上清液制备成一个样品。 6.3 样本存放 制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存,应置-70℃以下,避免反复 冻融。 6.4 病毒检测 6.4.1 检测步骤 取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条(即开即用),置于平整的台面上,向样品垫中分别 加入被检样品、阳性对照和阴性对照各100μL,每个试验同时做平行。室温放置15min,观察检测线和 质控线条带。 6.4.2 质量控制 质控线条带出现颜色,阳性对照检测线条带出现颜色,阴性对照检测线条带不出现颜色,检测结果 有效。如果质控线条带不出现颜色,或阳性对照检测线条带不出现颜色,或阴性对照检测线条带出现颜 色,出现任何一种现象以上者,说明检测结果无效,另选一批次试纸条重新按6.4.1操作。 6.4.3 增敏实验 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加入100μL的PBST缓冲溶液进行清洗,反复清洗 3次,每次1min,然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加入30μL增敏试剂,室温反应5min~8min后, 观察检测线条带颜色。 6.4.4 结果判定 检测线条带出现颜色,判定为阳性;检测线条带不出现颜色,判定为阴性。 注:增敏前条带颜色为红色,增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。 7 结果的确认 可疑阳性样品应采用莴苣花叶病毒RT-PCR检测方法进行确认。 2GB/T28975—2012 8 样品的保存与复核 种子类样品保存6个月,如果发现带毒样品保存1年。植株中发现病毒的,采集病叶干燥后保存于 -20℃条件。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档,以便必要时复核。复核程 序按照GB/T23632—2009中第6章进行操作。 3GB/T28975—2012 附 录 A (资料性附录) 莴苣花叶病毒相关资料 A.1 寄主范围 寄主范围很广,自然寄主有莴苣(Lactucasativa)、野莴苣(L.seriola)、蓝琉璃繁缕(Andgallisar- vensis)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、红花(Corthamustinctorius)、藜(Chenopodiumalbum)、墙生藜(C. murale)、芹叶牻牛儿苗(Erodiumcicutarium)、宝盖草(Lamiumamplexicaule)、香豌豆(Lathyrusod- oratus)、小花锦葵(Malvaparviflora)、豌豆(Pisumsativum)、欧洲千里光(Seneciovulgaris)、菠菜 (Spinaciaoleracea)、繁缕(Stellariamedia)等;接种可侵染蔬菜、花卉和烟草中的10科植物。 A.2 病害症状 莴苣症状多变,但通常表现为明脉和黄斑驳。感病表现明脉黄斑驳,常有叶脉坏死并呈古铜色。病 株不能包心,里面的叶片持续短小,呈丛簇状。鹰嘴豆(Cicerarietinum):叶黄化。碗豆 (Pisumsativum):褪绿,叶斑驳。 A.3 分布地区 世界范围均有分布。 A.4 传播方式 该病毒可通过汁液、种子、花粉及介体蚜虫(Aphisgossypii、Macrosiphumeuphorbiae、M.gei和 Myzuspersicae)传播。 4GB/T28975—2012 附 录 B (规范性附录) 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定莴苣花叶病毒试剂材料 B.1 胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标莴苣花叶病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片,免疫金释 放时间小于5min,释放效率大于80%;硝酸纤维素膜的检测线上包被了莴苣花叶病毒多克隆抗体;质 控线上包被了1mg/mL的羊抗鼠IgG;吸水垫为吸水纸。其结构见图B.1。 其中:玻璃纤维素片:吸水速率大于4s/cm,吸水量大于50mg/cm2; 硝酸纤维素膜(NC膜):毛细流动速率大于25s/cm; 吸水纸:吸水速率大于3s/cm,吸水量大于100mg/cm2; 聚氯乙烯(PVC)板:初粘力大于或等于3号球,持粘力标准条件下大于80h。 图B.1 胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 B.2 样品提取缓冲液 PBST 1L 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g PVP(MW24000~40000) 20g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 4℃储存。 5GB/T28975—2012