ICS17.180 A60 中华人民共和国国家标准 GB/T28873—2012 纳 米颗粒生物形貌效应的 环境扫描电子显微镜检测方法通则 Generalguideofenvironmentalscanningelectronmicroscopyfor biologicaleffectsontopographyinducedbynanoparticles 2012-11-05发布 2013-02-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中国科学院提出。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。 本标准负责起草单位:国家纳米科学中心。 本标准参加起草单位:中国科学院电工研究所、中国人民解放军第二军医大学。 本标准主要起草人:韩东、韩立、陈佩佩、谢家仪、杨勇骥、殷伯华、孙全梅、褚卫国、初明璋、金麟、 李静。 ⅠGB/T28873—2012 纳米颗粒生物形貌效应的 环境扫描电子显微镜检测方法通则 警告:本标准并未指出所有可能的安全问题。在应用本标准之前,使用者有责任采取适当的安全和 健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了环境扫描电子显微镜检测纳米颗粒与生物样品相互作用的技术和规范。 本标准适用于应用扫描电子显微镜的低真空和环境真空模式,进行纳米颗粒生物效应研究中生物 样品形貌的分析(颗粒的范围可扩展至亚微米级和微米级)。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T19619—2004 纳米材料术语 GB/T21636—2008 微术分析 电子探针显微分析(EPMA) 术语 GB/T23414—2009 微术分析 扫描电子显微术 术语 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 环境扫描电子显微镜 environmentalscanningelectronmicroscope;ESEM 在其工作时,其样品室气压可在1Pa~5000Pa之间变化。因此,不能直接探测到发射的二次电 子,图像是通过探测气体放大的电子、环境扫描电子探测器、探测离子、光电效应或者探测其他信号(如 背散射电子或者吸收电流)来获得。 3.2 生物形貌效应 biologicaleffectontopography 与纳米颗粒作用后,生物样品形貌的改变。 3.3 低真空模式 lowvacuummode 镜筒在高真空,而样品室的压力在10Pa~130Pa时,对样品表面进行检测。 3.4 环境真空模式 environmentalvacuummode 镜筒在高真空,而样品室的压力在10Pa~4000Pa范围内,对样品表面进行检测。 3.5 含水生物样品 hydrousbiologicalsample 表面无多余水分存在、内部含水、不易变形的新鲜样品。 1GB/T28873—2012 4 基本原理 用聚焦的高能电子束照射生物样品表面的微小区域,到达样品的电子与样品的原子发生碰撞,产生 大量携带有样品表面信息的二次电子和背散射电子等信号。控制电子束在样品表面以光栅形式进行扫 描,扫描时探测器(二次电子或背散射电子探测器)收集的电子信号随之变化,电子信号经探测单元处理 后,在显示器上形成生物样品的表面形貌和结构的电子图像。 ESEM的两个关键技术使直接观察生物样品成为可能。首先,ESEM采用多级压差光阑技术,形 成梯度真空,即镜筒保持高真空的同时,样品室的压力可在10Pa~4000Pa范围内调节,样品室的温度 可在-5℃~50℃范围调节。通过调节温度和压力,相对湿度可在0~100%范围变化。合适的湿度可 以使生物样品在观察时,样品室保持在“湿”的自然状态;其次,采用气体二次电子探测器,通过二次电子 对气体分子的电离作用,一方面使生物样品微弱的二次电子信号放大,另一方面所产生的正离子可与样 品表面电子中和从而消除生物样品表面的荷电。这样,含水的、导电性差的生物样品就可以直接在ES- EM中获得清晰的、无荷电效应的图像(见图1)。 图1 环境真空模式成像原理 5 仪器设备 5.1 环境扫描电子显微镜。 5.2 临界点干燥仪。 6 纳米颗粒作用后的生物样品制备 6.1 低真空操作模式下的样品制备 6.1.1 与纳米颗粒作用之后的生物样品(组织或细胞)先用2.5%戊二醛溶液固定2h~4h,后用磷酸 盐缓冲液(0.2mol/L,pH值为6.8~7.4)清洗3次;再用1%锇酸溶液固定2h~4h,磷酸盐缓冲液 (0.2mol/L,pH值为6.8~7.4)清洗3次。每次磷酸盐缓冲液清洗时间均为15min~20min。 6.1.2 分别用浓度为30%、50%、70%、85%、95%的乙醇将样品脱水各一次,每次15min~20min。 100%的乙醇脱水2次,每次15min~20min。 6.1.3 乙酸异戊酯置换生物样品2次,每次15min。 6.1.4 二氧化碳临界点干燥仪干燥生物样品。 6.1.5 样品表面不需导电处理,直接置于样品室内进行观察。 2GB/T28873—2012 6.2 环境扫描操作模式下的样品制备 纳米颗粒与生物含水样品作用之后,用滤纸去除表面多余水份,置于样品室内,直接进行检测。对 易变形生物样品可先给与2.5%戊二醛和1%锇酸双固定,然后用磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH值为 6.8~7.4)清洗3次,每次磷酸盐缓冲液清洗时间均为10min,再用去离子水清洗2次,每次清洗时间为 10s。最后用滤纸去除表面多余水分,置于样品室,进行检测。 7 样品检测流程 7.1 打开样品室 向环境扫描电镜样品室注入氮气,打开样品室。 7.2 选择及安装相应探头 选择低真空或环境真空模式。并安装相应的探头,低真空模式安装低真空探头,环境真空模式安装 环境真空探头。 7.3 安装样品 7.3.1 低真空模式,用导电胶或胶带,如银胶、碳胶或碳胶带,将样品固定在样品台上。 7.3.2 环境真空模式,安装相应的冷台和/或水循环系统,将样品装在特制的样品台上,选择合适的温 度,预冷。 7.4 抽真空并选择参数 抽真空,在低真空和环境真空模式下,根据样品的特点选择合适的参数:如压力、加速电压、束径和 工作距离。环境真空模式下还需选择温度-5℃~60℃,从而达到适合的湿度(一般推荐为85%)。 7.5 打开加速电压 一般推荐为1kV~15kV。 7.6 调节成像参数 选择亮度、对比度,出图像后,调整工作距离,在低真空和环境真空模式下,由于信号较弱建议选择 较小的工作距离6mm~8mm,束径的选择要根据ESEM型号而定。 7.7 视野选择 在低倍下选择合适的视野,寻找纳米颗粒生物效应后的细胞及生物组织表面的形貌。 7.8 放大及聚焦 放大到所需倍数,聚焦(在照相所需倍数两倍以上聚焦)。 7.9 高倍下消像散 7.10 照相并储存图像 3GB/T28873—2012 8 检测结果报告 检测结果报告需包括以下内容: a) 检测报告的唯一编号; b) 送样人姓名,单位、地址及联系方式; c) 送检样品名称、送检日期和送检目的; d) 仪器条件、检测参数(工作距离、加速电压、放大倍数、样品室压力、样品台温度和样品室湿度); e) 检测结果和必要的说明(附图片); f) 检测报告负责人的签字; g) 检测报告的页码; h) 检测报告的日期; i) 实验室名称和地址。 检测报告发布可参考附录A。 4GB/T28873—2012