ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T28715—2012 饲 料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 Determinationofacidicandneutralproteaseactivityinfeedadditives— Spetrophotometricmethod 2012-09-03发布 2013-02-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准起草单位:农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心(杭州)、浙江大学饲料科 学研究所、武汉新华扬生物有限公司。 本标准主要起草人:王小骊、柳爱春、邹晓庭、吴琪、赵芸、朱加虹、陈小丽、周樱、谢红云。 ⅠGB/T28715—2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力的测定方法。 本标准适用于饲料添加剂酸性、中性蛋白酶产品中酶活力的测定,以及复合酶产品中中性蛋白酶活 力的测定。 本标准定量限为500U/g(U/mL)。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酸性、中性蛋白酶活力单位 acidicandneutralproteaseactiveunit 在一定温度(40℃±0.2℃)和相应的pH条件下(酸性蛋白酶pH3.0,中性蛋白酶pH7.2),在 1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量,为1个酶活单位, 以U表示。 4 原理 蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸), 在碱性条件下,可将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。 通过在680nm测定其吸光度,得到酶解产生的酚基氨基酸的量,进而计算蛋白酶活力。 5 试剂和材料 除非另有说明,在分析中使用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682规定的二级水。 5.1 碳酸钠溶液[c(Na2CO3)=0.4mol/L] 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,用水溶解并定容至1000mL。 5.2 三氯乙酸溶液[c(CCl3—COOH)=0.4mol/L] 称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。 1GB/T28715—2012 5.3 盐酸溶液[c(HCl)=1mol/L] 取浓盐酸85mL,加水稀释并定容至1000mL,即为1mol/L盐酸溶液。 5.4 盐酸溶液[c(HCl)=0.1mol/L] 取100mL1mol/L盐酸溶液(5.3),定容至1000mL,即为0.1mol/L盐酸溶液。 5.5 氢氧化钠溶液[c(NaOH)=0.5mol/L] 取氢氧化钠20g,加水稀释并定容至1000mL,即为0.5mol/L氢氧化钠溶液。 5.6 福林(Folin)试剂 于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100.0g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱 中加入硫酸锂(Li2SO4)50g,水50mL和数滴浓溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷却后 仍有绿色需再加溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却后加水定容至1000mL。混匀、过滤。试剂应呈金 黄色,贮存于棕色瓶内。使用时,以1份福林(Folin)试剂与2份水混匀,制成稀福林(Folin)试剂。 5.7 乳酸缓冲液(pH3.0,适用于酸性蛋白酶) 甲液:称取10.6g乳酸(85%~90%),加水稀释并定容至1000mL。 乙液:称取16g乳酸钠(70%),加水稀释并定容至1000mL。 使用溶液:取4份甲液,加乙液(约1份)调整pH至3.0±0.05,此溶液在4℃冰箱贮存,有效期为 3d。 5.8 磷酸缓冲液(pH7.2,适用于中性蛋白酶) 分别称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)2.34g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)1.00g,用水溶解,用 0.1mol/L盐酸溶液(5.4)或0.5mol/L氢氧化钠溶液(5.5),单向调整pH至7.2±0.05,并定容至 1000mL,备用。 5.9 1%酪蛋白溶液 5.9.1 1%酸性酪蛋白溶液(pH3.0) 准确称取酪蛋白1)1.000g,先用约0.5mL浓乳酸湿润后,再加入乳酸缓冲液(5.7)约80mL,在沸 水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解,冷却后,用0.1mol/L盐酸溶液(5.4)或0.5mol/L 氢氧化钠溶液(5.5),单向调整pH至3.0±0.05,并转入100mL容量瓶中,用乳酸缓冲液(5.7)定容至 刻度。此溶液在4℃冰箱贮存,有效期为3d。 1) 标准使用的酪蛋白由中国药品生物制品检定所提供。给出这一信息是为了给使用者提供一个相对标准,如果 其他产品能有相同的效果,则可以使用等效产品。5.9.2 1%中性酪蛋白溶液(pH7.2) 准确称取酪蛋白1)1.000g,先用约0.5mL氢氧化钠溶液(5.5)湿润后,再加入磷酸缓冲液(5.8)约 80mL,在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解,冷却后,用0.1mol/L盐酸溶液(5.4) 或0.5mol/L氢氧化钠溶液(5.5),单向调整pH至7.2±0.05,并转入100mL容量瓶中,用磷酸缓冲 液(5.8)定容至刻度。其余同5.9.1。 2GB/T28715—2012 5.10 L-酪氨酸标准物质 纯度≥95%。 5.11 L-酪氨酸标准储备溶液 精确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸标准物质0.1000g,用20mL1mol/L盐酸溶液 (5.3)溶解后,再用蒸馏水定容至100mL,即为1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液。 5.12 L-酪氨酸标准溶液 临用前,准确吸取10.0mL1mg/mL酪氨酸标准储备溶液(5.11),用0.1mol/L盐酸溶液(5.4) 定容至100mL,即得到100μg/mLL-酪氨酸标准溶液。 6 仪器与设备 除常用实验室仪器设备外,应有下述仪器设备: 6.1 分光光度计:波长范围350nm~800nm。 6.2 pH计:精度为0.01pH单位。 6.3 分析天平:感量0.0001g和0.01g。 6.4 恒温振荡水浴锅(或普通水浴锅):精度为±0.2℃。 6.5 秒表或定时钟。 7 分析步骤 7.1 标准曲线绘制 分别准确吸取100μg/mLL-酪氨酸标准溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、 5.00mL和6.00mL于10mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,制成每毫升分别含L-酪氨酸0.0μg、 10.0μg、20.0μg、30.0μg、40.0μg、50.0μg和60.0μg的标准工作溶液。 分别吸取L-酪氨酸标准工作溶液1.0mL,加5.0mL碳酸钠溶液(5.1)和1.0mL稀福林(Folin) 试剂(5.6),于具塞试管中(每个浓度做2个平行),混匀。 将标准管同时置于40℃水浴,反应20min,取出,置于冷水中,迅速冷却至室温,用10mm比色皿, 以空白管调仪器零点,在分光光度计波长680nm处测吸光度。以L-酪氨酸含量为横坐标,以吸光度为 纵坐标,绘制标准曲线,获得线性回归方程。回归系数(r2)在0.9978以上时,方可使用,否则应重做。 新配制的福林(Folin)试剂应制作新的标准曲线。 7.2 试样制备 7.2.1 液体酶试样的制备 根据样品酶活力大小,吸取适量的液体酶液,酸性蛋白酶试样用乳酸缓冲液(5.7)[中性蛋白酶试样 则用磷酸缓冲液(5.8)]稀释至酶活力约为5U/mL~20U/mL,待测。 7.2.2 固体酶试样的制备 将试样粉碎或充分碾碎,过孔径为0.25mm筛。根据样品酶活大小,称取0.2g~2g样品,精确至 3GB/T28715—2012 0.001g,置于250mL锥形瓶中,酸性蛋白酶试样准确加入100mL乳酸缓冲液(5.7)[中性蛋白酶试样 则加入磷酸缓冲液(5.8)],搅拌使试样充分混匀,30℃100r/min振荡水浴(或用普通水浴锅,每5min 搅拌1次),水浴提取30min,摇匀,用中速定性滤纸过滤。滤液用乳酸缓冲液(5.7)[中性蛋白酶试样 则用磷酸缓冲液(5.8)],稀释至酶活力约为5U/mL~20U/mL,推荐的样品第二次稀释倍数见表1。 表1 推荐样品第二次稀释的倍数 样品酶活/(U/mL或U/g) ≤5000 5000~5000050000~100000 ≥100000 稀释倍数 1 10 20 50 7.3 测定步骤 取三支10mL具塞试管(一支样品空白管,两支样品管),分别向三支试管中准确加入稀释好的待 测酶液各1.0mL,将试管放入40℃±0.2℃水浴中预热5min,向两支样品管中加入1.0mL经同样 预热的1%酪蛋白溶液(5.9),准确计时反应10min,迅速、准确地向三支试管中加入2mL0.4mol/L 三氯乙酸溶液(5.2),于样品空白管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液(5.9),摇匀。将三支试管继续置 40℃±0.2℃水浴中放